Vistas:0 Autor:Editor del sitio Hora de publicación: 2022-04-03 Origen:Sitio
1. ¿Qué es la detección de ácido nucleico?
Definición de ácido nucleico: el ácido nucleico es un tipo de macromoléculas biológicas conectadas por nucleótidos o desoxinucleótidos a través de 3 ', 5' - fosfato Diéster Bond.
El ácido nucleico tiene funciones biológicas muy importantes, principalmente almacenando y transmitiendo información genética.
2. Clasificación de ácidos nucleicos.
Las macromoléculas de ácido nucleico se pueden dividir en dos categorías: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN).
3. Composición del ácido nucleico.
El ADN y el ARN se forman conectando la cabeza y la cola de un nucleótido, que se compone de cinco elementos: C, H, O, N y P.DNA es el material genético de la mayoría de los organismos. El ARN es un material genético de unos pocos virus libres de ADN, como el VIH, la influenza, el virus del SARS, etc. La longitud promedio de ARN es de aproximadamente 2000 nucleótidos, mientras que el ADN humano es muy largo, aproximadamente 3x10 ^ 9 nucleótidos.
4. Función de ácido nucleico.
Juega un papel en el almacenamiento y la transmisión de información genética en la replicación de proteínas y la síntesis. El ácidoacleico no solo es el material genético básico, sino que también juega un papel importante en la biosíntesis de la proteína. Por lo tanto, desempeña un papel decisivo en una serie de fenómenos de vida importantes, como el crecimiento, la herencia y la variación.
El ADN y el ARN son ácidos nucleicos. ¿Cuáles son las diferencias en su composición química de la siguiente manera:
5. Método de prueba
El método de detección de ácido nucleico detecta principalmente el ácido nucleico diana en la muestra que amplifica simultáneamente el ácido nucleico objetivo y generando la señal detectable. Puede aplicarse a la detección de ácido nucleico en la microbiología clínica, la detección de sangre, el diagnóstico y la prevención de la enfermedad genética, la medicina forense y otros campos.
En la actualidad, los métodos principales utilizados son los siguientes:
un. Amplificación dependiente de la secuencia de ácido nucleico
La NASBA es una nueva técnica para la amplificación isotérmica del ARN mediado por un par de cebadores, que es continuo y una secuencia de nucleótidos uniformes y específicos en vitro. La reacción se llevó a cabo a 42 ℃, y la plantilla de ARN podría amplificarse aproximadamente 109 veces en 2 HORAS.El principio de la NASBA es extraer ARN viral, agregue la transcriptasa inversa AMV, RNase H, T7RNA polimerasa y cebadores para la amplificación. La reacción completa se divide en fase no cíclica y fase cíclica: en la fase no cíclica, imprimación I y plantilla Los ARN se recocen para sintetizar el ADNc bajo la acción de la transcriptasa inversa AMV para formar ARN: ADN HYBRID, luego RNASEH DEGADA ARN, el cebador II y el ADNc se recocen para sintetizar la segunda cadena complementaria de ADN bajo la acción de la transcriptasa inversa. La polimerasa, el ADN de doble cadena se puede iniciar por su secuencia promotora para transcribir ARN. El ARN se puede transcribir inversa en ADN bajo la acción de la transcriptasa inversa, ingrese la fase de circulación y amplifique una gran cantidad de plantillas.
B. Amplificación mediada por la transcripción
El principio técnico de TMA es básicamente el mismo que el de la NASBA. La ligera diferencia es que TMA utiliza MMLV Transcriptasa inversa y T7RNA polimerasa. MMLV La transcriptasa inversa tiene tanto la actividad de la transcriptasa inversa y la actividad RNasa H. La reacción se llevó a cabo a 41.5 ℃, y la plantilla de ARN podría amplificarse aproximadamente 109 veces en 1 hora.
C. Reacción en cadena catalizada de ligasa (LCR)
LCR es una tecnología de amplificación de sonda basada en la interconexión de las sondas de oligonucleótidos dependientes de la molécula diana. Es una tecnología de amplificación in vitro prometedora desarrollada después de que el principio de PCR.sits sea hibridando la sonda de ADN de un solo segmento de oligonucleótido con la secuencia de destino. Cuando la sonda de ADN de dos segmentos se desvanece con la plantilla sin mutación, si las dos sondas están adyacentes y no hay un intervalo de nucleótidos en el medio, se pueden conectar debajo de la acción de la ligasa, y la nueva cadena después de la conexión se puede usar como un Plantilla para guiar la conexión en el siguiente ciclo para producir submarinulas nuevas. Si la mutación base de nucleótidos se produce en la sección de conexión, no se puede producir la reacción de conexión y se termina la reacción de amplificación.
D. Ensayo de reacción en cadena de polimerasa (PCR)
El principio básico de la tecnología de PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN, y su especificidad depende de los cebadores de oligonucleótidos complementarios a ambos extremos de la secuencia de destino. PCR consiste en tres pasos de reacción básicos: extensión de recocido de desnaturalización.
① Denaturación de la plantilla ADN: Después de que el ADN de la plantilla se calienta a aproximadamente 93, durante un tiempo determinado, la doble cadena de ADN de la plantilla o el ADN de doble cadena formado por la amplificación de PCR se disocia para formar una sola hebra, de modo que se puede combinar Con los cebadores para prepararse para la próxima ronda de reacción.
② Recocido (reembolso) de la plantilla de ADN y cebador: después de que el ADN de la plantilla se calienta y se desnaturaliza en una sola hebra, la temperatura baja a aproximadamente 55 ℃, y el cebador está emparejado con la secuencia complementaria de la cadena de ADN de la plantilla.
③ Extensión de imprimación: bajo la acción de la polimerasa TaqDna, la plantilla de ADN, el conjugado de cebadores utiliza DNTP como la materia prima de reacción y la secuencia de destino como plantilla para sintetizar una nueva cadena de replicación semi retenida complementaria a la cadena de ADN de la plantilla de acuerdo con el principio de emparejamiento de base y semi retenido. replicación. Repita los tres procesos de la extensión de recocido de desnaturalización cíclica para obtener más \"Cadenas de replicación semi retenidas\", y esta nueva cadena puede convertirse en la plantilla para el próximo ciclo. Tarda 2-4 minutos y 2-3 horas para amplificar el gen objetivo Para ampliar millones de veces. Para detectar ARN del VIH, necesitamos transcribir ARN en ADNc por reacción de transcripción inversa, y luego Amplificación de PCR con ADNAM como plantilla. Esta reacción se llama RT-PCR.
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